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基因組DNA提取

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酵母雙（單）雜交cDNA文庫(kù)構(gòu)建

1. 服務(wù)流程

1.1 客戶樣品QC

1.2 Total RNA的提取。

1.3 mRNA的分離。

1.4 以mRNA為模板進(jìn)行cDNA雙鏈的合成。

1.5 對(duì)合成的cDNA雙鏈進(jìn)行分級(jí)純化。

1.6 將分級(jí)純化的cDNA與pDONR222載體進(jìn)行重組反應(yīng)。

1.7 將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH10B感受態(tài)細(xì)胞。

1.8 cDNA文庫(kù)的QC。

a) 檢測(cè)文庫(kù)庫(kù)容量。

b)隨機(jī)挑取32個(gè)克隆子，PCR檢測(cè)平均插入片段大小，陽(yáng)性率。

1.9 初級(jí)文庫(kù)鋪板，抽提質(zhì)粒

1.10 初級(jí)文庫(kù)質(zhì)粒與PDEST22（或者pGADT7,pGADT7-Rec,pGADT7-Rec2, PCDNA3.1 或者其他任意指定

載體，根據(jù)客戶需求確定載體）載體進(jìn)行重組反應(yīng)，電轉(zhuǎn)化，檢測(cè)文庫(kù)質(zhì)量。

a) 檢測(cè)文庫(kù)庫(kù)容量。

b)每個(gè)文庫(kù)隨機(jī)挑取32個(gè)克隆子，PCR檢測(cè)平均插入片段大小，陽(yáng)性率。

2.送樣要求

2.1 針對(duì)每個(gè)文庫(kù)，客戶需提供至少能提取500ug總RNA的樣本，或者至少500ug總RNA。

3.發(fā)貨內(nèi)容

3.1 我們提供構(gòu)建好的酵母文庫(kù)的甘油菌液（含20%甘油的LB培養(yǎng)基），擴(kuò)增后初級(jí)文庫(kù)甘油菌，初級(jí)

文庫(kù)中抽質(zhì)粒，隨機(jī)克隆子的PCR鑒定圖譜，文庫(kù)構(gòu)建報(bào)告，酵母雙雜交篩選相關(guān)細(xì)胞和質(zhì)粒。

4.質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

4.1 文庫(kù)庫(kù)容量：大于1*10^7 CFU。

4.2 平均插入片段：大于1.2Kbp。

4.3 陽(yáng)性率：大于95%。

5.服務(wù)時(shí)間

30個(gè)工作日內(nèi)

收費(fèi)：人民幣30000.00

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基因甲基化檢測(cè)

甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA Methyltransferase, DNMT）催化作用下, 利用S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine, SAM）提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶環(huán)的五號(hào)碳原子上加上甲基的共價(jià)修飾過(guò)程。DNA甲基化修飾現(xiàn)象廣泛存在于多種有機(jī)體中，是*早發(fā)現(xiàn)的修飾途徑之一，是表觀遺傳學(xué)（Epigenetics）的重要組成部分。大量研究表明，DNA甲基化不改變DNA的**結(jié)構(gòu)，但是能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而在基因的表達(dá)及其調(diào)控、DNA的復(fù)制、細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、X染色體失活、衰老以及許多人類疾病 （如發(fā)育畸形、癌癥、心血管疾病、糖尿病和神經(jīng)心理失調(diào)等）發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用。 DNA的甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶和少量的N6-甲基腺嘌呤及7-甲基鳥嘌呤。在高等生物中，5-甲基胞嘧啶多發(fā)于CpG二核苷酸序列中，基因組中60%-90%的CpG是甲基化的。在甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）的催化作用下，利用S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供的甲基，使CpG二核苷酸序列中的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶。由于甲基化胞嘧啶極易在進(jìn)化中丟失，高等真核生物中CpG序列遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其理論值，但在基因組的某些區(qū)域中，通常是基因的啟動(dòng)子和**外顯子區(qū)，CpG序列密度很高，可以達(dá)均值的5倍以上，成為鳥嘌呤和胞嘧啶的富集區(qū)，形成所謂的CpG島。哺乳類基因組中約存在4萬(wàn)個(gè)CpG島，大多位于轉(zhuǎn)錄單元的5’區(qū)。CpG島的高甲基化是腫瘤中存在的普遍現(xiàn)象，而啟動(dòng)子CpG 島的高甲基化是除突變和缺失外腫瘤中抑癌基因失活的第三種機(jī)制。因此，基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)在**診斷、藥物敏感性檢測(cè)等方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

服務(wù)項(xiàng)目：

1．甲基化特異性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）

      用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變；隨后設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化和非甲基化序列的引物進(jìn)行PCR。通過(guò)電泳檢測(cè)MSP擴(kuò)增產(chǎn)物，如果用針對(duì)處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴(kuò)增片段，則說(shuō)明該位點(diǎn)存在甲基化；反之，說(shuō)明被檢測(cè)的位點(diǎn)不存在甲基化。

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特點(diǎn)：適用范圍廣，能夠檢測(cè)特異位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化。

2．亞硫酸氫鹽測(cè)序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）

用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。隨后設(shè)計(jì)BSP引物進(jìn)行PCR，在擴(kuò)增過(guò)程中尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，*后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序就可以判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化，稱為BSP-直接測(cè)序法。將PCR產(chǎn)物克隆至載體后進(jìn)行測(cè)序，可以提高測(cè)序成功率，這種方法稱為BSP-克隆測(cè)序法。

   特點(diǎn)：**度高，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出甲基化的程度百分比。

送樣要求：

細(xì)胞（≥106 個(gè)）、組織（≥300mg）、血液（≥1ml）、血清（≥1.5ml）等樣品材料，基因組DNA（體積≥20μl，濃度≥50 ng/μl）。

服務(wù)價(jià)格：